背景
細(xì)菌培養(yǎng)基的光密度（OD）測定是微生物學(xué)中使用的一種常見技術(shù)。研究人員主要依靠分光光度計(jì)來進(jìn)行這些測定，然而實(shí)際上這個(gè)測定是基于培養(yǎng)基的光散射量而不是光吸收量。在其標(biāo)準(zhǔn)配置中，分光光度計(jì)并未對光散射測定進(jìn)行優(yōu)化，這通常會導(dǎo)致儀器間所測得吸光度上的差異。
方法
該研究調(diào)查了不同的分光光度計(jì)光學(xué)配置對在分批培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌JM109光密度測定的影響。分光光度計(jì)檢測包括了使用陣列檢測的反向光學(xué)系統(tǒng)、基于單色器的傳統(tǒng)系統(tǒng)以及一種配備積分球配件（ISA）的單色器系統(tǒng)。在每個(gè)儀器上測定OD600生長曲線，同時(shí)，對McFarland進(jìn)行CFU/mL計(jì)數(shù)來進(jìn)一步對每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
結(jié)果
來自相同光學(xué)配置類別的分光光度計(jì)其OD數(shù)據(jù)是相當(dāng)的。用反向光學(xué)系統(tǒng)測定較高OD時(shí)數(shù)據(jù)變化更大，這是由較低雜散光所導(dǎo)致。基于單色器的系統(tǒng)測試較高OD時(shí)準(zhǔn)確度較高，主要是因?yàn)榕c來自反向光學(xué)系統(tǒng)的多色光相比，單色光具有更好的雜散光去除能力。然而，反向光學(xué)系統(tǒng)測定OD時(shí)卻有具有良好的動態(tài)范圍。使用ISA產(chǎn)生出的數(shù)據(jù)與用其它系統(tǒng)產(chǎn)生出的數(shù)據(jù)不同，這是因?yàn)槠渚哂胁蹲綆缀跛星跋蛏⑸涔獾哪芰Α６鴮?/span>McFarland標(biāo)準(zhǔn)品的測定確認(rèn)了這些現(xiàn)象。
結(jié)論
分光光度計(jì)進(jìn)行可靠的光散射測定的能力在很大程度上取決于其光學(xué)配置；因此，具有不同光學(xué)配置的分光光度計(jì)會呈現(xiàn)出不同的OD測定值。理想狀態(tài)下，高度散射樣品（如細(xì)胞培養(yǎng)基）的吸光度是使用ISA進(jìn)行測定的，目的是為了捕捉幾乎所有的散射光。培養(yǎng)基生長可使用OD600測定，然而每當(dāng)改變分光光度計(jì)時(shí)，就應(yīng)該計(jì)算和應(yīng)用一個(gè)換算因數(shù)。
引言
培養(yǎng)基中細(xì)菌生長（遲緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期和衰亡期）各個(gè)階段都能記錄下來，其中對數(shù)期被認(rèn)為是細(xì)菌分裂最快的階段（1）。使用分光光度計(jì)測定細(xì)菌培養(yǎng)基在600nm（OD600）時(shí)的光密度，從而監(jiān)控細(xì)菌生長一直是微生物學(xué)中的一種核心技術(shù)。使用細(xì)菌OD600的三種更為常見的應(yīng)用如下：（a）在細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，找到誘導(dǎo)蛋白的最佳時(shí)間，（b）用于最小抑菌濃度（MIC）實(shí)驗(yàn)的接種體濃度的確定和標(biāo)準(zhǔn)化，和（c）收獲和制備感受態(tài)細(xì)胞的最佳時(shí)間的確定。研究人員繼續(xù)依靠分光光度計(jì)進(jìn)行這些OD測定。然而，光密度不是一個(gè)吸光度指標(biāo)，而是細(xì)菌混懸液的一種光散射指標(biāo)，將其自身作為吸光度顯示（圖1）。分光光度計(jì)光學(xué)配置對光密度測定的影響得到了很好的記錄（2-4）。具有不同光學(xué)配置的儀器對同一細(xì)菌混懸液測定得到了不同的光密度。分光光度計(jì)光學(xué)配置上的差異對觀察到的差異影響最大。前向光學(xué)系統(tǒng)采用單色光來進(jìn)行吸光度的測定，而反向光學(xué)系統(tǒng)則利用多色輻射進(jìn)行測定，光在其穿過樣品后再區(qū)分成單獨(dú)波長（圖2）。前向光學(xué)系統(tǒng)的一些要素導(dǎo)致了測得OD值上的差異：（a）樣品與檢測器之間的距離，（b）聚光透鏡的尺寸和焦距大小不同，和（c）檢測器的面積和靈敏度（5）。盡管現(xiàn)在都知道不同的光學(xué)配置會產(chǎn)生不同的OD值，但是研究人員仍繼續(xù)關(guān)注在不同分光光度計(jì)間發(fā)現(xiàn)的OD值差異。在本研究中，我們分析了多種光學(xué)配置分光光度計(jì)測出的OD值差異。我們在分批培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌JM109，并監(jiān)控OD達(dá)9.5小時(shí)。在測定之前稀釋培養(yǎng)基，并將由于不同分光光度計(jì)光學(xué)元件差異造成的不同OD值進(jìn)行換算。
儀器 | 光學(xué)系統(tǒng) | 光學(xué)幾何學(xué) | 光源 | 檢測器 |
Evolution Array | 反向光學(xué) | | 氘和鎢燈 | 光電二極管陣列 |
NanoDrop 2000c | 反向光學(xué) | | 氙燈 | CMOS陣列 |
SPECTRonIC 200 | 反向光學(xué) | | 鎢燈 | CCD陣列 |
Evolution 260 Bio | 前向光學(xué) | 前向光學(xué) | 氙燈 | 硅光電二極管 |
Evolution 300 | 前向光學(xué) | 前向光學(xué) | 氙燈 | 硅光電二極管 |
BioMate 3S | 前向光學(xué) | 雙光束 | 氙燈 | 硅光電二極管 |
結(jié)果
從未稀釋和稀釋的培養(yǎng)基中收集的OD600數(shù)據(jù)如圖3所示。將來自稀釋溶液的OD600值乘以稀釋因數(shù)，并與未稀釋的樣品進(jìn)行對比。兩張圖的分歧表明，不同的光學(xué)配置在光密度測定方面會有不同的動態(tài)范圍。當(dāng)對比每個(gè)分光光度計(jì)的校正OD值與細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，具有相似光學(xué)系統(tǒng)的儀器產(chǎn)生了相似的OD曲線（圖4）。具有前向光學(xué)系統(tǒng)，但卻是雙光束光學(xué)幾何結(jié)構(gòu)的BioMate 3S，與儀器組的差異最大。McFarland數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出一種與大腸桿菌生長相似的曲線（圖5）。ISA使用McFarland標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生了更低的光密度（圖6）。
圖1結(jié)論
·計(jì)算OD測定值時(shí)，確定您所用分光光度計(jì)的光密度性能和動態(tài)范圍是至關(guān)重要的。為獲得有關(guān)生長曲線的最準(zhǔn)確信息，稀釋細(xì)胞混懸液是很重要的。
·OD測定在很大程度上取決于光學(xué)系統(tǒng)和幾何學(xué)。對于相同的混懸液，具有不同光學(xué)系統(tǒng)和配置的分光光度計(jì)會讀出不同的OD值。例如，在反向光學(xué)系統(tǒng)Evolution Array和前向光學(xué)系統(tǒng)，雙光束BioMate 3S之間有實(shí)質(zhì)性的分歧。
·積分球配件（ISA）可捕捉幾乎所有的前向散射光，從而產(chǎn)生了更低的光密度。這是因?yàn)橥ǔ？雌饋肀?/span>
樣品吸收的散射光實(shí)際上是被ISA配件所收集。ISA對測定高度散射溶液中分析成分的吸光度是理想之選；然而，在測定細(xì)胞混懸液的光密度時(shí)，其是無效的。
·最后，我們提出了如何計(jì)算一個(gè)可用于使OD數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以便能在不同分光光度計(jì)間進(jìn)行適當(dāng)比較的換算因數(shù)。值得注意的是，這個(gè)換算因數(shù)是針對一種特定的有機(jī)體，因?yàn)槲⒘５某叽绾托螤顣绊憮Q算因數(shù)。
分光光度法中的光散射
致。
B 在一個(gè)散射樣品中（如一種細(xì)菌混懸液），到達(dá)檢測器的光會因光散射而進(jìn)一步減少。到達(dá)檢測
器光的減少造成了樣品吸光度增
長的錯(cuò)覺。
圖2前向和反向光學(xué)系統(tǒng)之間的差
異
在前向光學(xué)系統(tǒng)中
